通过这几道实例习题，让你掌握GraphPad Prism统计分析

GraphPad Prism可谓数据分析表现小能手，能文能武能统计能画图~在我们的单元课中，有跟大家分享了Prism如何正经地作图以及变换数据花式做图，那它做统计时如何施展拳脚的，以下让我们由浅入深的来学习下。

习题一

MCF-7细胞过表达MKL-1、STAT3,或MKL-1加上STAT3，检测N-cadherin的相对表达量，pCDNA3.1为对照。请用合适的统计方法对下列模拟数据进行分析：

 

再给个示例图提示

本题示例图来源于文献PMID：28499590；Fig 1A

答案：单因素ANOVA

看结构这只有一个分组的维度，即细胞的处理方式不同，所以在Prism里数据录入的形式应该选择Column。但Prism的方向跟Excel不同，组别分列，样本（或重复测量值）分行，所以在Excel中复制数据后，到Prism里要用“Ctrl+Shift+T”来粘贴，将数据转个90º。组名也是一样的做法。

接下来，多组数据之间的比较，首先想到单因素ANOVA；但要先做正态性检验，若不符合正态分布，则应采用非参数检验。 1） 正态性检验：点工具栏上的Analyze之后，在弹窗中选择Column statistics，勾选上所有组别。

点OK之后的弹窗中，把高斯分布（即正态分布）下的三个检验方法都勾上。简单理解一下这三种方法：当样本量大时，三种方法的结果大同小异；样本量小时，一般只有SW法能计算出结果。至于大小样本的界定，还有不少争议，如30、200、2000为界。没把握就先都选上再看咯。Prism推荐第一种，但第二、三种更常用，SPSS里就是提供后两种的结果。

说句题外话，Prism开发组似乎不太喜欢KS法，因为不灵敏，认为它只是个历史情怀。在新版使用说明中讲到：“早期版本我们曾提供KS法，现在还是把它放在这（为了保持一贯性），只是不再推荐。”毫不掩饰的一脸嫌弃.jpg，所以不造将来的版本是否会淘汰它。本例中N=3，果然只有SW法能出结果，并且很直白地告诉你有没有通过（pass）正态性检验，这里是Yes，符合。

2） 单因素ANOVA 再点一下Analyze，在刚才Column statistics的上方就是one-way ANOVA。同样勾选所有组别。

接下来的弹窗，在第一个选项卡（实验设计）中，本例都是独立样本，所以选第一个，没有匹配。下边是否假设为高斯分布，刚才检验过了，选符合。 Tips：注意区别Prism中使用的两个很容易混淆的词组，replicate values和repeated (或matched、paired) measures。前者可以理解为独立样本，如本文每个实验都重复做至少3次，用分别制备的质粒和细胞，就属于replicate。如果同一份细胞检测处理前和处理后的蛋白表达，则属于时间上有匹配的样本，要选用repeated / matched / paired的相关算法，这个以后会说。

 

第二个选项卡多重检验，选择各组间如何比较，都跟对照组比还是各组都两两比较，还是跟哪个特定组比。本例就选全都两两比较。

但多组的两两比较会增加族错误率，所以要采取一些较正方法，通常用Bonferroni，也可以点开下拉框选择其他，比如Tukey、Sidak。下边控制假阳性率是Prism新增的方法，你也可以试试。

点OK之后，结果中包含好几个表，先看ANOVA总表。上边的summary中的p值表示这些组是否有统计学差异，但具体在哪组还不知道。下边的Brown-Forsythe检验即方差齐性检验（若每组都N>5，则还有Barttlet检验）。方差齐也是应用单因素ANOVA的前提之一，不齐则仍需做非参数检验。在SPSS里是要主动勾选是否做方差齐性检验的（用Levene法），而Prism则默默地算好了。最后一句仍是直白提示，各组标准差没有显著差异，所以是可以继续应用ANOVA的结果的。

所以接下来看下边的多重比较表：

哪组跟哪组比、有没有差异、P值、可以打几个星号之类的细节都有了。这就可以标在图上了。（你问为啥跟示例图不一样？跟你讲了这是模拟数据不是原文数据嘛~）在图上打标注的方法也很简单，就用工具栏上的画图和文字工具就可以了。

习题二

先来看看昨天的那道思考题：MCF-7细胞用野生型（WT）和突变型（M）Vimentin promoter的荧光素酶质粒后，再分别进行和上题一样的过表达处理。请用合适的统计方法对下列模拟数据进行分析：

示例图来自文献，PMID：28499590；Fig 2B

答案：双因素ANOVA

这回有两个分组维度，一个是MKL-1和/或STAT3，看它们是否促进MCF-7细胞的Vimentin的转录；一个是野生型和突变型是否有差异。所以在Prism里应选择分组（Grouped）的数据类型，填3个重复测量值。

然后直接从Excel原形贴过来就行。

 

分析方法就显然是双因素ANOVA。点Analyze之后，找到Two-way ANOVA，把所有组都选上。

接下来选择实验设计，这里是独立样本，没有匹配。下边的因子名称纯粹为了阅读报告方便，自己随缘填填吧。

在多重比较选项卡中，因为我们既想了解各行（即MKL-1和/或STAT3过表达）间的差别，又想了解各列（即CArG box是否有突变时）间的差别，所以选交叉比较。校正方法继续选用Bonferroni呗。

 

第一个总表也就看一眼，各行、各列和交叉比较都是有差异的。

下一个多重比较表则是看具体的两两比较结果。

啊好多呀~根据实验意义选取有用的来描述吧。

习题三

25对肾细胞癌（RCC）患者的癌和癌旁组织样本，用qRT-PCR检测miR-766-3p的表达。为减小系统误差每个样本有3个测量值。请选择合适的统计方法对下列模拟数据进行分析：

截取前5例

 

示例图来源于文献，PMID：28657135；Fig 1A

答案：配对T检验

这回只有一个分组维度，并且题目已经说了是配对样本，就可想到配对T检验了。不过配对T检验本来是用Column的数据类型，但如果选Column的话，你是没法填上每个样本有3个值的数据的。这里有两种处理方法，一是可以在Excel中用AVARAGE()函数计算好均值，再贴到Prism中。另一种则是选择Grouped的数据形式，3个重复测量值，然后原样贴过来，Prism会自用采用均值计算。我就用第二种吧。

截取前5例配对T检验的前提则是组间的差值符合正态分布。且不同于非配对T检验，此处不要求方差齐。可以像课件里的那样先在Excel中计算出两组的差值，再贴到Prism里来做正态性检验，这是很正经的思路。不过我想说，Prism是个很调皮的软件，他们自己推荐的是先斩后奏法。点Analyze之后，在Column analyses里选择T检验，把两组都选上。

实验设计选择配对，下边的高斯（正态）分布先假装它符合。

在选项中，单尾还是双尾就是根据自己的知识和科学假说来选了。如果有理由推断某组应该比另一组大，则选单尾，如果出现哪组偏大都有理由解释则选双尾。下边是关键，勾选画出差值。

这样你会在结果中看到一个差值的表：

并且右下方会有弹窗提示，说T检验本来是为Column型数据设计的，没有亚组。现在有3个亚组，所以采用平均值来计算。这正是我想要的，Prism真乖~ 然后你在这个Differences表的界面上点Analyze，做正态性检验，还和第一题中所说的一样。

现在三种方法计算的结果一致，组间差值符合正态分布，那刚才的T检验结果就拿去用了呗~

P值如上，有显著差异。这个界面也会有弹窗提示说使用了平均值，看看就好。那么万一不符合正态分布呢？在结果报告表的界面，工具栏Analyze旁边有个改变参数的小图标：

然后改回非参数检验就可以了。或许你可以自己先画个频率分布直方图来看看形状估摸一下，提高命中率，省得后边改参数。画图的话，图片分类选Column，横条往右拉，找到前后对比图就行了，这能很好地表现配对数据。

习题四

10只小鼠随机分成两组，测试药物对指标M的影响，在服用药物前后不同时间点对指标M进行检测，结果如下，请分析药物A对指标M是否有影响。

这次木有文献，木有原图。

答案：样本匹配的双因素ANOVA

这数据可以理解为用两个维度来描述，一个维度是干预方法，一个维度是时间，而且在时间上形成配匹，所以用双因素ANOVA。 操作有点像第二题，但区别在于实验设计上，要选择每行代表不同时间点、纵向配匹样本。

在多重比较选项卡中，没有能一次满足我们需求的选项，所以得分两次做。一次是解决各时间点上药物组跟安慰剂组有没有区别的问题，后边Options里的校正方法如前。

另一次是解决各个时间点跟基线时间有没有区别。下边可选择每一单元跟对照组单元（第1行）比较，校正方法如前：

看看结果，第一次的分析如下，24h和48h时出现了不同处理之间的差异，后来又趋近了。

第二次分析结果则是，安慰剂对照组不出意外地变化不大，而药物组也是24h和48h与基线时间有差异，后来又趋近了。

画出图来大概就是这样：

习题五

LncRNA-A、miRNA-B、Gene-C的表达如下，共30例，请分析三者的表达关系：

截取前5例木有文献示例。

答案：线性回归或相关性分析

很明显，这是在同一批样本中检测了三个基因的表达，那么维度只有这一个。要看三者之间的两两关系，可以用简单的线性回归。选XY格式的数据表，把数据直接贴过来。点Analyze之后，你会很快看到XY analyses下有个线性回归的选项。不过下边还有一个大同小异的Correlation，一会再说说它。

后边的选项看起来复杂，其实也挺好理解，很多选项都默认就行了，所以原谅我懒一回不截图了~ 得到的结果有斜率、截距，以及表示相关程度的R2、P值。 画图时，可以选择各组分别出图，并加上拟合线：  这样就得到了两张图：  但线性回归是只能做一组X和各组Y之间的关系，所以如果要看B和C的关系，则要另建一个表，以B为X轴、C为Y轴再做一遍。不过刚才提到的Correlation，则提供了另一种办法。那就是不管X轴！把数据全贴到Y轴上。 这样，Analyze选Correlation之后，右边会出现三列，全选点OK来到下一个弹窗，选第一行计算各个Y轴数据之间的相关性。下方会提示根据数据是否符合正态分布，从而决定用Pearson法还是Spearman法。单尾双尾的选择如前述。 得到R值的矩阵就是这个样子： 还有一个P值的矩阵： P值的意义我们都熟悉了。在具有统计显著性的基础上，看看各对变量之间的R值，正相关还是负相关、相关程度如何。这个R和线性回归里的R是一样的，只不过报告中一个有平方一个没平方。并且散点图没有拟合线。它们的确有所区别。线性回归多是用于预测，在X轴可控、可干预的情况下预测Y轴事件的变化。而相关性分析多用于观察现象，看两者是否同步变化及其变化的关系，无所谓谁是X谁是Y。但也看到有些学者不主张把它俩分这么清楚，毕竟算出来都一样，而线性回归也是给它们的关系提供一种描述方式。所以你也会发现不少文献里会用线性回归描述相关性。不过到画图时就要想一下了，如果再多几组，则有一种表现策略是作散点图矩阵。 这种矩阵图当然对角线上下两半是一样的，可以只画其中一半，随你~ 不要怀疑，上图就用R做的，示个意而已~大家可以探索下用Prism怎么做。R只有一句咒语：plot(Data)，没错又是因为我懒。（但这么短的命令只能管素颜）再用R值矩阵做个热图，表现各组间相关程度。这回是Prism了（格子少的热图是真丑，我就示个意~>_<~）：